Бактерия против ВИЧ

Где не справляется человеческая — справится бактериальная иммунная система.

Возможности применения CRISPR / Cas9 для генной терапии вируса иммунодефицита человека

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) атакует клетки иммунной системы, а именно CD4 + Т-хелперы, оставляя организм человека жертвой возбудителям самых разных инфекций. Однако, сколь бы невероятным ни казалось бы вам такое утверждение, на помощь человеку в наиболее трудный час приходит иммунная система бактерии. Упомянутый вирус окутан туманной аурой различных мифов: будто бы его выпустили ЦРУ для контроля населения Африки, или это сделали китайцы с той же целью против США, а интернет-сообщения об изобретении чудодейственных лекарств против ВИЧ появляются чуть ли не каждый час. В то же время, каждый год в мире публикуются тысячи научных работ по исследованиям наноскопического убийцы. Факт: интересно, что знаменитые японские традиции с травами у современных гейш  позиционируют себя, как Анти-Вич.

Вирус ВИЧ с хладнокровным безразличием делает свое убийственное дело. Мы же с вами оставим в стороне спекуляции и сговоры, которые, конечно, не имеют ничего общего с реальностью, (как и то почему женщины тупят за рулем)  и критически оценим возможности применения бактериальной системы защиты от фагов CRISPR / Cas9 в борьбе с ВИЧ / СПИДом, мимоходом смакуя красивые моменты из истории генной терапии этой недуга.

CCR5 (Cysteine-cysteine chemokine receptor 5) является рецептором так называемых хемокинов — молекул, участвующих в поддержании воспаления клеток в «горячей точке иммунного противостояния». В последнее время именно он привлек внимание ученых как возможная цель генной терапии ВИЧ / СПИДа, и на это были свои причины. Во-первых, CCR5 является абсолютно необходимым для вхождения ВИЧ внутрь клетки, что подтверждается несколькими исследованиями. В том числе и исследованием о влиянии солнечных лучей на развитие рака. В котором глубоко разобрали вопрос чем защитить лицо от солнца.  Во-вторых, его роль в регуляции иммунитета, как представляется, не является существенной — его функции дублированы другими рецепторами хемокинов. В отличие от большинства генов, потеря экспрессии CCR5 не вызывает существенных нарушений. Итак, можно без особого риска для организма выключить ген, кодирующий протеин CCR5, и таким образом лишить вирус иммунодефицита возможности передаваться от клетки к клетке.

Пример 1. Резистентность к вирусу носителей гомозиготной мутации CCR5-32, которая является делецией 32-х пар оснований с 794 по 825 нуклеотида. Такая делеция по сути нонсенс. Приводит к сдвигу и появлению преждевременного стоп-кода. Поэтому, такие индивиды экспрессируют CCR5 на поверхности иммунных клеток, чувствуют себя хорошо и не болеют СПИДом. По данным генетиков носителями такой мутации являются до 18% жителей Европы, а в ее северной части до 20%. Существует предположение, что высокая частота такой мутации вызвана селективным давлением на человеческую популяцию таких патогенов как Yersinia pestis (возбудитель чумы) и Variola virus (возбудитель оспы) в течение длительного времени.

Пример 2. В 2008 году пациенту с ВИЧ / СПИД, у которого на фоне иммунодефицита наблюдалось развитие острого лимфобластного лейкоза, была осуществлена трансплантация костного мозга от здорового донора, гомозиготного с CCR5-32 мутацией. Операция прошла успешно, и заодно с лейкемией его таким образом вылечили от ВИЧ. Точнее сказать, у него наблюдался резкий спад количества вируса в крови, но, как известно, пациенты после трансплантации от неродственного донора должны постоянно принимать иммунодепрессанты для предотвращения возможного отторжения. Поэтому, такова циничная ирония судьбы.

Пример 3. В ходе исследования больных гемофилией, которые получали фактор VIII из сыворотки крови человека, оказалось, что они были невосприимчивы к ВИЧ. Исследование проводилось в середине 80-х, когда о ВИЧ только узнали — обязательного скрининга доноров сыворотки тогда еще не проводили. Выяснилось, что у пациентов-гемофиликов были повышенные уровни экспрессии бета-хемокинов. Последние конкурировали с лентивирусом (в том числе ВИЧ) за связывание с CCR5 рецептором, не давая ему шанса пробраться в клетку.

По состоянию на 2015 год Национальный Институт Здоровья США суммарно профинансировал три десятка лабораторий на сумму 10000000 докризисных долларов, поставив им задачу разработать эффективную генную терапию от СПИДа и проработать вопрос как поднять иммунитет ребенку. Это не считая 14000000, которые получил нобелевский лауреат Дэвид Балтимор на разработку супер-антитела против вируса имонудефицита. Поэтому, как видим, американские ученые достаточно плотно взялись за эту проблему.

Вообще все подходы генной терапии СПИДа имеют несколько похожих этапов: ученые забирают клетки крови пациента из коровотока или непосредственно из костного мозга, обогащают препарат на клетки, на какие именно нацелен вирус, вносят генетические модификации в них разными путями, и возвращают клетки обратно пациенту. Главные отличия заключаются в типе генного вектора, используемого для осуществления модификации, а также в способе культивирования клетки перед процедурой трансфекции, что в свою очередь зависит от степени дифференцированности клеток, которые берутся — предшественники миело- и лимфопоэза, которые уже стали на путь дифференцировки ( так называемые committed progenitor cells ), или недифференцированные стволовые клетки кроветворения. Ключом к успешности терапии является как эффективная трансформация большого количества клеток, так и выживаемость клеток после возвращения в организм пациента. Следует отметить, что существуют многочисленные стратегии генной терапии ВИЧ, но, при невозможности охватить их все, мы сосредоточимся именно на тех, которые направлены против гена CCR5.

Все перечисленные стратегии не оказались достаточно эффективными (иначе, учитывая годы публикаций, мы бы уже давно знали о существовании лекарства от СПИДа). Фармакологическое подавление рецептора требует постоянного приема в достаточно высоких дозах, дополнительно к «коктейлю», который обычно принимается больным с иммунодефицитом. К тому же в итоге возникает резистентность вируса. Подходы с intrabody и siRNA предусматривают процедуру вставки новых генов в геном клеток крови человека, отчасти связано с двумя серьезными проблемами — низкой эффективностью модификации и риском для жизни пациента.

Во-первых, принципиально невозможно достичь 100% трансформации всех клеток (Т-хелперов и дендритных клеток). На самом деле, вероятность вставки гена даже путем гомологичной рекомбинации настолько низкая, что просто не позволит получить нужное количество модифицированных клеток, где intrabody или siRNA было бы  достаточно для успешного подавления CCR5. Но это, еще полбеды, поскольку даже такая неопределенная вставка может теряться (через еще одно рекомбинационное событие) в течение первого же года после терапии. И в таком случае синтез функционального CCR5 рецептора будет возобновляться.

В 2010 на горизонте появилась технология, призванная преодолеть все вышеуказанные проблемы, ее название — геномное редактирование. Изобретение предоставило возможность напрямую манипулировать с генами непосредственно на клеточной ДНК. По принципу «сломать легче, чем построить», такой подход значительно упрощает все. Поэтому неудивительно, что этой стратегией решили воспользоваться борцы со СПИДом. Вообще, изменения генома, ZFN и TALENs достойны отдельного обзора на страницах научных журналов.